طراحی آغازگر بهینه در تکنیک Real-Time PCR:
طراحی آغازگر بهینه برای تکثیر کارآمد توالی‌های مدنظر ضروری است. RT-PCR موفق بستگی به توانایی تکثیر یک محصول کوتاه (۳۰۰ > جفت باز، به‌طور ایده آل ۲۰۰-۱۰۰ جفت باز) دارد که ویژه mRNA است. این به این معنی است که یک یا هر دو آغازگر، با اتصال به اگزون‌ها در انتهای ۵ اگزون و انتهای ۳ اینترون، اینترون را straddle می‌کند. (طراحی آغازگر بهینه در تکنیک Real-Time PCR)
همچنین می‌توان آغازگرهای مؤثری را طراحی کرد که در دو طرف یک اینترون بزرگ قرار می‌گیرند و بنابراین در تکثیر cDNA بسیار کارآمدتر از تکثیر DNA ژنومی آلوده‌کننده هستند. بنابراین، طراحی مؤثر نیاز به اطلاعاتی در مورد DNA ژنومی یک ژن و هم‌ردیف کردن (Alignment) مستقیم با توالی کد کننده cDNA دارد.
اطلاعات توالی را می‌توان از تعداد سایت‌های اینترنتی که در دسترس عموم‌اند از جمله NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) و سایت EMBL (http://www.ebi.ac.uk/embl/) دانلود کرد.
این برنامه‌ها چندین عامل را برای بهینه‌سازی طراحی آغازگر در نظر می‌گیرند که شامل:
۱- حذف دایمرهای آغازگرها در نتیجه توالی مکمل بین آغازگرها
۲- جور بودن دمای اتصال بین آغازگرها
۳- مناسب بین دمای اتصال محاسبه‌شده و آغازگرها و دمای اتصال محصول PCR می‌باشد.
پس از انتخاب آغازگرها، یک جستجوی همسانی (Homology) را باید در برابر پایگاه داده ژنومی انجام داد تا مشخص شود که کجا آغازگرها ممکن است توالی همسان را تکثیر کنند.
چند خصوصیت مؤثر طراحی آغازگر RT-PCR زمان واقعی در زیر خلاصه‌شده است:
- جفت آغازگرها باید آمپلیکون با اندازه مناسبی را تکثیر کنند (۳۰۰> جفت باز، به‌طور ایده آل ۲۰۰-۱۰۰ جفت باز)
- آغازگرها باید یک اینترون را straddle کنند یا در کنار یک اینترون بزرگ باشند.
- جایگاه‌های اتصال آغازگر نباید ساختار ثانویه گسترده‌ای داشته باشد.
- انتهای ’ ۳آغازگر باید بدوم ساختار ثانویه و توالی‌های تکراری باشد.
- جفت آغازگر نباید زیاد باهم یا خود مکمل باشند
- جفت آغازگرها باید میزان تقریباً برابری GC (بین ۴۰% تا ۷۰%) و دمای اتصال مشابهی داشته باشند
دیدگاهتان را بنویسید