تکنیک های کشت
پروتوپلاست ها معمولا در محیط کشت های مایع یا نیمه جامد آگار کشت می شوند. در بعضی موارد به پروتوپلاست ها اجازه داده می شود که در محیط کشت مایع به سنتز دیواره سلولی جدید بپردازند و سپس آنها را به محیط کشت محتوی آگار منتقل می نمایند.
۱- کشت آگار :
از تکنیک کشت تک سلولی برگمن برای کشت پروتوپلاست ها استفاده می شود. مقداری از سوسپانسیون پروتوپلاستی با غلظت در برابر تراکم نهایی مورد نیاز، با حجم امساوی از محیط کشت محتوی آگار با غلظت دو برابر، مخلوط گردیده و به حالت مایع در ۴۵درجه سانتی گراد نگهداری می شود. غلظت آگار بایستی در حدی انتخاب شود که پس از اختلاط با سوسپانسیون پروتوپلاست ها، یک ژل آگار جامد ایجاد کند. پتری دیش ها با استفاده از پارافیلم درزگیری شده و به حالت معکوس در انکوباتور قرار داده می شوند.
با روش کشت آگار، پروتوپلاست ها در یک موقعیت ثابت باقی می مانند و از تجمع و به هم چسبیدن آنها جلوگیری می شود. پروتوپلاست های غیر متحرک در محیط کشت های نیمه جامد به تولید توده های سلولی می پردازند او این امر امکان تعیین دقیق کارآیی کشت را فراهم می آورد. انتقال پروتوپلاست های غیر متحرک به محیط غذایی دیگر به طور دستی امکان پذیر میباشد.
۲- کشت مایع:
در مراحل اولیه کشت پروتوپلاست، استفاده از سیستم کشت مایع به دلایل زیر ترجیح داده می شود:
۱-رقیق سازی و انتقال پروتوپلاست ها آسانتر است.
۲- پروتوپلاست های برخی گونه ها در محیط کشت های محتوی آگار تقسیم نمی شوند.
۳- فشار اسمزی محیط کشت را می توان به نحو مؤثری کاهش داد.
۴- بعد از چند روز از انجام کشت می توان تراکم سلولی را کاهش داد.
معایب کشت مایع:
اشکال کشت مایع این است که نمی توان به جداسازی تک کلنی های حاصل از رشد یک سلول والدی پرداخت.
تغییرات متعددی در روش های کشت پروتوپلاست صورت گرفته است:
۱- روش قطره مایع (Liquid droplet method):
در این روش پروتوپلاست ها را در محیط کشت های مایع به حالت سوسپانسیون در آورده و قطرات کوچکی به حجم ۲۰۰-۱۰۰ میکرولیتر از این سوسپانسیون را با استفاده از پیپت به پتری دیش های پلاستیکی ۶۰x۱۵ mm منتقل می نمایند. می توان ۷-۵ قطره را در هر پتری دیش کشت داد.
سپس پتری ها درزگیری شده و در انکوبات قرار داده می شوند. این روش برای آزمایشات میکروسکوپی مناسب است و برای ادامه رشد سوسپانسیون ها می توان مقداری محیط کشت تازه را در فواصل زمانی ۷-۵ روزه به محیط اضافه نمود. مشکلی که این روش با آن روبرو است این است که در بعضی موارد پروتوپلاست های کشت شده به صورت توده ای در مرکز قطره به هم می چسبند.
۲- روش قطره آویزان (langing droplet method):
قطرات کوچکی به حجم ۱۰۰-۴۰ از سوسپانسیون پروتوپلاست ها در سطح داخلی در پوش یک پتری دیش قرار داده می شود. وقتی که درپوش بر روی ظرف پتری قرار گیرد، قطرات کشت از آن آویزان می شوند. این روش نسبت به روش قطرهای مرسوم، امکان کشت تعداد کمتری پروتوپلاست در هر قطره را فراهم می آورد.
۳- لایه تغذیه کننده (Feeder layer):
در بسیاری از موارد، لازم است که برای جداسازی یک پروتوپلاست معین، تراکم کشت را به حداقل ممکن کاهش داد. یک لایه تغذیه کننده، شامل پروتوپلاست های تیمار شده با اشعه X و ناتوان در تقسیم، اما زنده است که در سطح محیط کشت آگار در پتری دیش کشت می شوند. پروتوپلاست ها در این لایه تغذیه کننده، با تراکم کم در یک لایه نازک از محیط غذایی آگار کشت می شوند. این روش، به ویژه در مواقعی که قرار است جهش یافته ها یا سلول های هیبرید خاصی را در محیط کشت آگار گزینش کرد، حائز اهمیت می باشد.
۴- کشت همجواری (co – culturing):
در این روش دو نوع پروتوپلاست گند رشد و تند رشد به صورت مخلوط کشت می شوند. یک سوسپانسیون پروتوپلاستی نسبتا تند رشد به نسبت های مختلف با پروتوپلاست های یک گونه کند رشد رکالسیترانت مخلوط می شود. پروتوپلاست های تند رشد احتمالا فاکتورهای رشد و ترکیبات شیمیایی قابل انتشار ناشناخته ای را برای گونه دیگر اهم می آورند که به باززایی دیواره سلولی و تقسیم پروتوپلاست های آن کمک می نمایند.
منبع: کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.
دیدگاهتان را بنویسید