روش امتزاج القایی:
در فرآیند هیبریداسیون سوماتیکی که هدف آن امتزاج پروتوپلاست هایی با منشاء مختلف است، امتزاج خودبه خودی ارزشی ندارد. برای نائل شدن به این هدف، ماده مناسبی به نام فیوژن (Fusogen) برای امتزاج پروتوپلاست ها با منشأهای متفاوت اضافه می شود. «تکنیک امتزاج القایی پروتوپلاست»
۱- تیمار با نیترات سدیم:
پاور و همکاران در سال ۱۹۷۰ برای اولین بار امتزاج پروتوپلاست ها را با استفاده از نیترات سدیم (NaNO3) گزارش نمودند.
- پروتوپلاست های جداشده، در مخلوطی از نیترات سدیم ۵/۵ درصد در محلول ۱۰٪ ساکارز به حالت تعلیق در می آیند.
- محلول محتوى پروتوپلاست ها را در حمام آب گرم در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه قرار داده و سپس به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ می نمایند.
- پس از سانتریفیوژ، بخش عمده ای از محلول فوقانی را دور ریخته و مقدار باقیمانده به همراه توده پروتوپلاست ها به حمام آب گرم در دمای ۳۰ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ دقیقه منتقل می شود. در طی این مرحله، بیشتر پروتوپلاست ها با یکدیگر امتزاج می یابند.
- بقیه محلول تلفیق را خارج نموده و آن را با محیط کشتی که حاوی ۰/۱ درصد نیترات سدیم است، جایگزین مینمایند.
- پروتوپلاست ها را در همین وضعیت، مدتی نگه می دارند و سپس آنها را با استفاده از محیط کشت، دو دفعه شستشو داده و بعد کشت می کنند. در این تکنیک، فراوانی تشکیل هتروکاریون ها کم است، به ویژه زمانی که از پروتوپلاست های مزوفیل برگ استفاده شود.
۲- استفاده از یون های کلسیم در pH بالا:
کلر (Keller) و ملشرز (Melchers) در سال ۱۹۷۳، تأثیر pH بالا و یون های کلسیم را بر امتزاج پروتوپلاست های توتون مطالعه کردند. در این روش، پروتوپلاست های جداشده را در یک محلول القاء کننده امتزاج که محتوی ۰/۵ مولار مانیتول و ۰/۰۵ مولار کلرید کلسیم دو آبه بوده، به مدت ۳ دقیقه سانتریفیوژ می کنند. سپس لوله های سانتریفیوژ محتوی پروتوپلاست ها را به مدت ۵۰-۴۰ دقیقه در حمام آبگرم با دمای ۳۷°C قرار می دهند. پس از این تیمار، ۵۰-۲۰٪ پروتوپلاست ها با یکدیگر امتزاج می یابند.
۳- روش پلی اتیلن گلیکول:
کائو (Ka0) و میشایلوک (Michayluk) در سال ۱۹۷۴، و والین و یاران در همان سال، روش استفاده از پلی اتیلن گلیکول را برای امتزاج پروتوپلاست ها ابداع نمودند. این روش یکی از موفق ترین تکنیک ها برای امتزاج پروتوپلاست ها می باشد.
-
روش استفاده از پلی اتیلن گلیکول:
۱- پروتوپلاست ها را محلولی که محتوی پلی اتیلن گلیکول با وزن مولکولی بالا می باشد، به حالت سوسپانسیون می آورند. محلول فوق عمل چسبیدن پروتوپلاست ها به یکدیگر و امتزاج آنها در بسیاری از گونه های گیاهی را سرعت می بخشد.
۲- اگر مقادیر کافی از پروتوپلاست ها در دسترس باشد، ۱ میلی لیتر سوسپانسیون پروتوپلاستی را با ۱ میلی لیتر محلول ۵۶-۲۸٪ پلی اتیلن گلیکول با وزن مولکولی ۶۰۰۰-۱۵۰۰ در یک محیط کشت مخلوط می نمایند.
۳- لوله محتوی مواد فوق را به مدت ۵ ثانیه تکان می دهند و سپس آن را به مدت ۱۰ دقیقه ثابت نگه می دارند تا مواد موجود در آن ته نشین شوند.
۴- سپس برای حذف PEG، پروتوپلاست ها را چند مرتبه با محیط کشت پروتوپلاست شستشو می دهند.
۴- الکتروفیوژن:
پروتوپلاست ها در یک ظرف کشت کوچک که دارای دو الکترود می باشد قرار داده می شوند. سپس یک اختلاف پتانسیل الکتریکی برقرار می گردد که باعث می شود پروتوپلاست ها به صورت ردیفی در حد فاصل الکترودها قرار گیرند. در این حالت اگر یک شوک الکتریکی موج کوتاه، به شدت اعمال گردد، پروتوپلاست ها را تحریک به امتزاج می نماید. این روش امتزاج، از دو مرحله تشکیل یافته است که با اعمال یک جریان الکتریکی متناوب کم شدت بر سوسپانسیون پروتوپلاستی شروع می شود.
هنگامی که هدایت الکتریکی محیط کشت سوسپانسیونی کمتر از sec/cm ۱۰۵ باشد و جریان متناوبی با پتانسیل ۱/۵ ولت و فرکانس مگاهرتز (MHZ) برقرار گردد، در اثر جریان الکتروفورزی حاصل، سلول ها در طول خطوط میدان الکتریکی به یکدیگر می چسبند. در مرحله دوم، یک جریان الکتریکی مستقیم با شدتی معادل V/cm ۷۵۰ – ۱۰۰۰ در مدت زمان ۵۰-۲۰ میکرو ثانیه در مدار برقرار می گردد که برقراری این جریان موجب شکستن غشاء پلاسمایی سلول ها در ناحیه اتصال آنها به یکدیگر می شود.
پس از شکستن غشاء پلاسمایی در ناحیه اتصال، دو سلول با یکدیگر امتزاج می یابند و غشاء پلاسمایی مجددا شکل می گیرد. تکنیک الکتروفیوژن، ساده و سریع است و بازده بالایی دارد. سلول ها پس از الکتروفیوژن سمیت نشان نمی دهند. با این وجود، این تکنیک به دلیل نیاز به تجهیزات خاص از مقبولیت چندانی برخوردار نگردیده است.
«تکنیک امتزاج القایی پروتوپلاست»
منبع: کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.
دیدگاهتان را بنویسید