تاریخ :۹ بهمن ۱۴۰۱
آنالیز داده Real-Time PCR

آنالیز داده Real-Time PCR

  • آنالیز داده Real-Time PCR

    پیش از ترتیب دادن آزمایش و آنالیز داده Real-Time PCR، طراحی آزمایش و چندین مرحله کنترل کیفیت اهمیت دارد. از جمله، کنترل‌های مثبت و منفی. این کار باعث اطمینان از این می‌شود که داده‌های Real-Time PCR که تولید می‌شوند، از کیفیت بالایی برخوردارند. بعلاوه، به دلیل کنترل کیفیت، هر نمونه‌ای در سه تکرار ران می‌شود. سریال‌های رقت نیز برای هر نمونه ران می‌شوند. سریال‌های رقت برای تعیین بازده تکثیر و رسم منحنی‌های استاندارد لازم هستند.

     Real-Time PCR

    Real-Time PCR

    آنالیز ریل تایم

    طراحی آزمایش Real-Time PCR و کنترل کیفیت

    آزمایش‌های Real-Time PCR معمولا باید شامل کنترل‌های زیر باشند:

    ۱- کنترل‌های منفی در آنالیز داده Real-Time PCR (حداقل دو نمونه)

    • بدون الگو
    • کنترل بدون ترانس­کریپتاز معکوس

    ۲- کنترل مثبت در آنالیز داده Real-Time PCR

    کمک می‌کند که مطمئن شویم که تمام مواد به‌درستی کار می‌کنند. یک یا هر دو را انتخاب کنید.

    • DNA (منبع DNA با مقدار معین که دارای توالی هدف است)
    • RNA (یک نمونه از RNA با مقدار معین که دارای RNA هدف است)

    کنترل بدون الگو در آزمایش Real-Time PCR

    تائید می‌کند که آلودگی در مواد PCR وجود ندارد. اگر باندی در کنترل بدون الگو تولید شود، ممکن است نشان دهد که یک یا چند ماده با الگو یا به‌احتمال‌زیاد، با محصول PCR تکثیر شده قبلی، آلوده‌ شده است. ماده خاصی که آلوده‌ شده است باید با مشکل یابی مشخص شود. اغلب، صرفه جویانه ­تر این است که تمام مواد به غیر از تک پلی‌مراز دور ریخته شوند و تنظیمات با کنترل منفی انجام شود. استفاده از تیپ‌های میکروپیپت دارای barrier برای تمام مواد RT-PCR می‌تواند از بیشتر مشکل‌ها جلوگیری کند. در برخی آزمایشگاه‌ها، میکروپیپت های جدا و معینی برای PCR و آنالیز کردن محصولات PCR استفاده می‌شوند.

    کنترل بدون ترانس­کریپتاز معکوس

    ران کردن یک کنترل بدون ترانسکریپتاز معکوس به تشخیص وجود DNA آلوده‌ کننده در RNA کمک می‌کند. اگر کنترل بدون الگوی منفی باشد و کنترل بدون ترانسکریپتاز معکوس یک باند تولید کند، به‌احتمال‌ زیاد DNA آلوده‌کننده‌ای وجود دارد که توسط آغازگرها شناسایی می‌شود.

    تیمار RNA الگو با DNase عاری از RNase باید مشکل را رفع کند. در برخی موارد آغازگرها را باید دوباره طراحی کرد تا از تکثیر هدف‌های DNA بالقوه جلوگیری شود. به‌طور شاخص این کار ممکن است نیاز به straddling یک اینترون متفاوت یا کمی جابه‌جا کردن انتهای ۳پریم آغازگر باشد. تا پتانسیل کمتری برای جفت شدن در انتهای ۳ پریم با توالی DNA ژنومی داشته باشد.

    طراحی آزمایش Real-Time PCR

    طراحی آزمایش Real-Time PCR

    کنترل مثبت در آزمایش Real-Time PCR

    زمانیکه Real-Time PCR برای اولین بار انجام می‌شود، استفاده کردن از کنترل مثبت مفید است. این کار به‌ویژه زمانی اهمیت دارد که نبود بیان ژن احتمال داشته باشد. کنترل مثبت می‌تواند RNA ،DNA یا هر دو باشند. استفاده از کنترل RNA اطلاعات با ارزشی را در مورد مراحل RT-PCR ارائه می‌دهد. اما ممکن است تهیه آن مشکل‌تر باشد. تهیه یک کنترل مثبت DNA اغلب آسان‌تر است و اطلاعاتی را در مورد بازده واکنش PCR ارائه می‌دهد. در نهایت، کنترل با کیفیت خوب تضمین می‌کند که داده‌های قابل‌اطمینانی به دست می­ آیند. جدول زیر برخی راهنمایی‌های اضافی یا روش‌هایی را که باید در طی انجام یک آزمایش زمان واقعی در نظر گرفت تا اطمینان داشت که داده‌های جمع‌آوری‌شده قابل‌اعتمادند، خلاصه‌وار نشان می‌دهد.

    معیار

    روش

    آزمایش باید شامل کنترل‌های بدون الگو و بدون ترانسکریپتاز معکوس باشد.

    از تیوب‌های عاری از RNase که برای تهیه ترمال سایکلر مناسب هستند، پیت‌های با تیپ‌های مانع دار و دستکش استفاده کنید تا از الو دکی RNase جلوگیری کنید.

    کنترل کیفی RT-PCR

    به‌صورت دستی آستانه را برای تشخیص محصول PCR، طبق استانداردهایی که در آزمایشگاه بنانهاده شده، به دست آورید.

    اگر آستانه را به‌صورت دستی تعیین کنید تا جایی که ممکن است آن را پایین انتخاب کنید تا مطمئن باشید که محصول را در زمان فاز نمایی تکثیر شناسایی کنید.

    منحنی‌های ذوب همه نمونه‌ها باید بررسی شود تا اطمینان حاصل شود که همه یک پیک تولید می‌کنند.

    زمانی که شیب‌های نمونه‌ها به‌صورت لگاریتمی رسم می‌شود باید موازی باشد.

    نمونه‌هایی که در چرخه ۱۰ یا قبل از آن قابل‌شناسایی هستند باید رقیق شوند.

    کنترل کیفی PCR زمان واقعی

    اسید هسته‌ای که برای منحنی استاندارد استفاده می‌شود باید به‌دقت تعیین کمیت شده باشد و با استفاده از میکرو پیپت کالیبره شده رقیق شود.

    پنج نقطه یا بیشتر را برای منحنی استانداردی که برای تعیین کمیت مطلق استفاده می‌شود در نظر بگیرید.

    رقت‌هایی که اندازه‌گیری فلورسنت آن­ها باهم خط آستانه را قطع می‌کند، حذف کنید.

    ضریب همبستگی برای اینکه مشخص شود که در یک نمودار لگاریتمی الگو تا چه حد نمونه‌های رقیق‌شده باید منطبق بر خط مستقیم باشند، باید برابر یا بالاتر از ۹۹% باشد.

    کنترل کیفی منحنی استاندارد

    امتیاز شما به این مقاله چقدره؟

    میانگین امتیازات ۵ از ۵
    اشتراک‌گذاری

    دیدگاهتان را بنویسید

    نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.