تاریخ :۹ فروردین ۱۴۰۳
آشنایی با آغازگرهای سنجاق سری در تکثیر DNA

آشنایی با آغازگرهای سنجاق سری در تکثیر DNA

  • آشنایی با آغازگرهای سنجاق سری در تکثیر DNA

    گاهی در تکثیر DNA را از آغازگرهای سنجاق سری کوچک استفاده می شود. ردیف، طول و ساختار ثانویه آغازگرها در میزان تکثیر قطعه ها تاثیر می گذارد. برای مثال آغازگرهای کوتاه مورد استفاده در روش DAF تعدای بیشتری از قطعه های تکثیری نسبت به روش RAPD ایجاد می کنند. ولی گاهی به دلیل وجود قطعه های پالیندروم (ایجاد حلقه سنجاق سری) در قطعه های تکثیری، کارایی اتصال آغازگرهای کوچک کاهش می یابد. در این مقاله از دی مگ به آشنایی با آغازگرهای سنجاق سری در تکثیر DNA و روش های مورد استفاده از آن می پردازیم.

    آغازگرهای سنجاق سری

    با قرار دادن یک ساختار پایدار سنجاق سری در انتهای ‘۵ آغازگر می توان کارایی اتصال آغازگر را افزایش داد. این ساختار شامل سه تا چهار نوکلئوتید در حلقه و دو نوکلئوتید در ساقه است. سنجاق سر کوچک به طور طبیعی به صورت نواحی تکراری در ژن های RNA دیده شده است. همچنین آغازگرهای سنجاق سری کوچک از طریق اتصال یک ردیف اختیاری مرکزی در انتهای ‘۳ آنها طراحی می شوند. با قراردادن ردیف های اختیاری سه نوکلئوتیدی در انتهای ‘۳ یک سنجاق سر کوچک می توان تعداد زیادی از آغازگرهای کوتاه و نزدیک به هم را طراحی کرد.

    سنجاق سر کوچک مورد استفاده در طراحی آغازگر باید شامل الیگومرهای پایداری باشند که دمای ذوب زیادی (۷۱ تا ۷۶ درجه سانتیگراد) دارند. نمونه این نوع آغازگرهای سنجاق سر کوچک الیگونوکلئوتید (GCGAAGC(HP7 و سری های N GCGNAAGC میتواند یکی از چهار نوکلئوتید A ،G ،C یا T باشد.

     آغازگرهای سنجاق سری در تکثیر DNA

    آغازگرهای سنجاق سری در تکثیر DNA

    روش های استفاده از آغازگرهای سنجاق سری

    سه روش عمده ای که در آنها از آغازگرهای سنجاق سری کوچک برای پیمایش کردن ژنوم و افزایش چند شکلی استفاده میشود عبارتند از :

    ۱- روش دف با استفاده از آغازگرهای دارای ساختار سنجاق سری کوچک (mhpDAF)

    در این روش از آغازگر های DAF که در انتهای ‘۵ خود ساختار سنجاق سری دارند، استفاده میشود. به کمک این آغازگرها میتوان انگشت نگاری قابل اطمینانی از هر نوع DNA الگو به دست آورد.

    ۲- علائم اختیاری نیمرخ های تکثیری یا ASAP

    در این روش که در حقیقت انگشت نگاری نیز نامیده می شود، ابتدا تکثیر اولیه DNA با آغازگرهای اختیاری صورت می گیرد و سپس محصولات تکثیر شده با آغازگرهای سنجاق سری کوچک یا آغازگرهای استاندارد اختیاری تکثیر مجدد می شوند. در حقیقت روش ASP در دو مرحله ژنوم موجود را مورد پیمایش قرار می دهد. از آنجا که در هر مرحله می توان یک یا چند آغازگر با ردیف متفاوت را برای تکثیر قطعه ها مورد استفاده قرار داد، هر ترکیب می تواند انگشت نگاری خاص خود را ایجاد کند.

    برای مثال اگر ۱۰ الیگومر در اختیار باشد، می توان ۱۰۰ ترکیب جفتی داشته باشیم. اگر دو آغازگر در مرحله اول تکثیر استفاده شوند، ۱۰ هزار ترکیب آغازگری خواهیم داشت که تقریبا ۹۰ درصد انگشت نگاری ها منحصر به فرد خواهند بود. در حقیقت در گام نخست تعداد قطعه های تکثیری اولیه مشخص می گردد و در گام دوم تنوعات موجود در قطعه های اولیه تکثیر شده نمایان می شود.

    در مرحله دوم می توان از آغازگرهایی که مکمل جایگاه های ریز ماهواره هستند استفاده کرد. به طوری که نتایج انگشت نگاری دف (گام اول) با این آغازگرها تکثیر مجدد شوند. مزیت این روش این است که نواحی با چندشکلی زیاد شناسایی می شوند. و در برخی موارد به صورت نشانگر همبارز، آلل ها را می توان شناسایی کرد. متاسفانه در این حالت علاوه بر موتیف SSR، ردیف های اختیاری غیر وابسته نیز تکثیر می گردند و تعداد زیادی باند ایجاد می کنند که تفسیر هم بارزی را مشکل می سازند.

    ۳- الگوی برش اندونوکلئازی پروفیل تکثیری چندگانه اختیاری (teeMAAP)

    در این روش ابتدا اسید نوکلئیک الگو در معرض هضم آنزیمی قرار می گیرد و پس از آن با یک یا چند آغازگر الیگونوکلئوتید اختیاری تکثیر صورت می گیرد.

    منبع: کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران.

    امتیاز شما به این مقاله چقدره؟

    میانگین امتیازات ۵ از ۵
    اشتراک‌گذاری

    دیدگاهتان را بنویسید

    نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *