مرحله کشت بافت بساک:
١- پانیکول ها یا خوشه ها را زمانی که میکروسپورهای آنها در مرحله تک هسته ای قرار دارند از گیاه جدا نمایید. این مرحله را می توان از روی موقعیت نسبی برگ پرچمی بر روی ساقه تشخیص داد. ساقه ها را در ناحیه زیرین گره ای که پانیکول از آن منشاء گرفته است، با اسکالپل ببرید.
۲- پیش تیمار سرما را در دمای ۴°C بمدت یک هفته بر روی ساقه هایی که برش داده شده اند و در یک ارلن محتوی آب نگهداری می شوند، اعمال کنید. در اثر این تیمار تعداد بیشتری از بساک ها در محیط کشت به تولید کالوس خواهند پرداخت.
۳- برگ پرچمی را جدا نموده و پانیکول ها یا خوشه ها را با قرار دادن در محلول تجارتی هیپوکلریت سدیم ۲۰درصد بمدت ۱۰ دقیقه استریل نمایید و سپس آنها را حداقل ۴ بار با آب مقطر استریل شستشو دهید.
۴- پانیکول یا خوشه بریده شده را در سطح یک لام شیشه ای یا پتری دیش استریل قرار دهید. با وارد آوردن فشار توسط لبه های پنس، بساک ها را از گلچه ها خارج نمایید. هر گلچه برنج دارای ۶ بساک است.
-
مرحله القاء کالوس:
۵- برای القاء کالوس، بساک ها را بصورت افقی بر روی محیط کشت N محتوی ۶ ساکارز و ۲/mg 1 هورمون توفوردی قرار دهید. حدود ۶۰ بساک را در یک پتری دیش به ابعاد mm ۱۵ × ۶۰ می توان کشت نمود.
۶- پتری دیش ها را درز گیری نموده و در دمای ۲۷ درجه سانتیگراد برای برنج و یا ۲۰-۲۲ درجه سانتیگراد برای جو در تاریکی انکوبه نمایید.
۷- پس از ۴-۳ هفته که کالوس ها یا کلونی ها شروع به ظهور می نمایند، بساک را برداشته و به محیط کشت MS محتوى
۰/۰۵mg/L NAA + 2 mg/L KIN انتقال دهید.
۸- کشت ها را تحت شدت نوری متوسط و فتوپریود ۱۶ ساعت نور و ۸ ساعت تاریکی قرار دهید.
۹- توده های ساقه را که بصورت اجتماعی از ساقه های منفرد تشکیل می شوند، در زمانی که حدود ۱cm طول دارند، جدا نموده و هر ساقه را به یک ظرف محتوی محیط کشت NAA یا MS+ 1mg/L IBA برای القاء ریشه انتقال دهید.
۱۰- وقتی که ساقه ها و ریشه ها بخوبی رشد یافتند، گیاهان را به گلدان انتقال دهید.
۱۱- گیاهان هاپلوئید را شناسایی نمایید.
-
مرحله انجام دیپلوئیداسیون :
۱۲- با تیمار کلشی سین، عمل دیپلوئیداسیون کروموزم ها را انجام دهید. گیاهان شاداب را در مرحله ۴-۳ برگی از خاک بیرون آورید و پس از شستشوی خاک از ریشه آنها، ریشه ها را در فاصله ۳ سانتی متری زیر طوقه ببرید. گیاهان را در شیشه های دهانه گشاد محتوی محلول کلشی سین که از حل ۲/۵ گرم کلشی سین در ۲۰ میلی لیتر دی متیل سولفوکساید و رساندن حجم محلول به ۱ لیتر با آب مقطر تهیه شده است، قرار دهید. به طوری که محلول کلشی سین طوقه ها را بپوشاند. گیاهان را در دمای اتاق به مدت ۵ ساعت نگهداری نمایید و پس از شستشوی کامل ریشه ها با آب، آنها را در خاک سبک کشت کنید.
منبع: کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.
دیدگاهتان را بنویسید