طراحی پرایمر و سنتز آن
طراحی پرایمر و سنتز آن: پرایمر در واقع چیزی نیست مگر یک قطعه اسید نوکلئیک. که پژوهشگر در نظر دارد از وجود آن در یک قطعه، ژنوم یا توده DNA مورد مطالعه اطلاع حاصل کرده. و یا وقایع درون و پیرامون آن را بررسی کند. این قطعه اسید نوکلئیک در بیشتر موارد یک قطعه DNA است که ممکن است ردیف آن شناخته شده یا مجهول باشد. برای مثال چنانچه فردی مایل به بررسی و مطالعه ایزوفورم های مختلف یک ژن باشد، ممکن است قطعه DNA را که به عنوان کاوشگر مورد استفاده قرار می دهد، قطعه ای از ژن باشد که ردیف آن معلوم است.
اما چنانچه هدف پژوهشگر تخمین فاصله ژنتیکی یا گروه بندی تعدادی از جانوران در حال انقراض باشد، ممکن است هر قطعه DNA را از آن جانور یا گونه های مجاور آن یا حتی DNA ساختگی و تصادفی به عنوان کاوشگر مورد استفاده قرار گیرد.
سنتز پرایمر
روش های مختلفی برای سنتز پرایمر وجود دارد. یکی از رایج ترین روش های آن، استفاده از کتابخانه های ژنومی است. در این روش مجموعه ژنوم موجود با استفاده از آنزیم های محدودگر قطعه قطعه شده و هر یک همسانه سازی می شوند. در واقع به این ترتیب کتابخانه هایی ایجاد می شوند که کتاب هایشان همان قطعه های ِDNA هضم شده هستند که درون پلاسمیدها وارد شده اند.
تهیه کتابخانه های ژنومی
تهیه کتابخانه های ژنومی با استفاده از روش های مختلفی صورت می گیرد. اگرچه این کتابخانه ها بسته به روش مورد استفاده دارای تفاوت های اساسی با یکدیگر هستند. ولی به هرحال اصول کلی تهیه کتابخانه های ژنومی تقریبا یکسان است.
-
روش تهیه کتابخانه های ژنومی
۱- برای تهیه کتابخانه ژنومی از یک موجود زنده، ابتدا باید DNA آن را استخراج کرد. کیفیت DNA دارای اهمیت خاصی در تهیه کتابخانه مناسب می باشد.
۲- DNA خالص شده با آنزیم محدودگر خاصی برش داده می شود. انتخاب نوع آنزیم نیز دارای اهمیت خاصی است. زیرا علاوه بر این که دامنه اندازه قطعه های DNA موجود در کتابخانه را تعیین می کند، باید به صورت منحصر به فردی در درون پلاسمید یا حامل این قطعه ها نیز وجود داشته باشد. به طور همزمان حامل مناسب برای همسانه سازی DNA هضم شده، با همان آنزیم برش داده می شود.
۳- پس از هضم جداگانه DNA ژنومی و حامل، آنها را در مجاورت هم قرار داده و با آنزیم لیگاز به هم دوخته می شوند. به این ترتیب در داخل هر یک از حامل ها یک قطعه DNA هضم شده ژنوم مورد نظر وارد شده است.
۴- این پلاسمیدهای نوترکیب برای تکثیر و نگهداری به داخل یک باکتری منتقل می شوند. به این ترتیب کتابخانه ای از قطعه های DNA ژنومی ایجاد می شود که در داخل یک پلاسمید در درون سلول های باکتریایی قرار گرفته اند.
حامل های مورد استفاده برای تهیه کتابخانه های ژنومی
از حامل های متعدد و مختلفی می توان برای همسانه سازی DNA و تهیه کتابخانه های ژنومی استفاده کرد. مهمترین این حامل ها عبارتند از:
- پلاسمید،
- لامبدا،
- کروموزوم مصنوعی مخمر
- و کروموزوم مصنوعی باکتری.
اما برای تهیه کتابخانه ژنومی با cDNA، به منظور تهیه پروب برای RFLP، معمولا از پلاسمید استفاده می شود. پلاسمید ساده ترین و یکی از کوچکترین نوع حامل است که می تواند قطعه هایی کوچک تر از ۴ کیلوباز را در خود جای دهد.
تهیه کتابخانه های cDNA
اصول تهیه کتابخانه ها ژنومی و کتابخانه های cDNA یکسان است. تنها تفاوت موجود در این است که برای تهیه کتابخانه های cDNA به جای استخراج ِDNA و هضم آن با یک آنزیم محدودگر، RNA از بافت مورد نظر و در زمان مورد نظر استخراج می شود و از روی آن cDNA ساخته می شود. سپس cDNA ساخته شده در درون پلاسمید مورد نظر همسانه سازی می شود. بنابراین در حالی که بدون توجه به بافت و زمان استخراج DNA از یک موجود فقط یک کتابخانه ژنومی می توان تهیه نمود، کتابخانه های cDNA متعددی را می توان از بافت ها و در شرایط متفاوتی تهیه کرد.
منبع: کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران.
دیدگاهتان را بنویسید