امروزه علاوه بر فناوری بررسی انگشت نگاری در داخل ژل، روش های دیگری که بر بررسی چند شکلی و شناسایی جهش در فاز جامد مبتنی اند نیز ایجاد شده اند که قادرند تغییر در یک نوکلئوتید را مشخص کنند. (آنالیز پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی در فاز جامد)
در بررسی چند شکلی در ژل الکتروفورز احتمال آلوده شدن محلول ها و وسایل مورد استفاده زیاد می باشد. در حالی که در استفاده از فاز جامد نه تنها میزان آلودگی در حد زیادی کاهش می یابد، بلکه در مدت زمان کمتر می توان به نتایج دلخواه دست یافت.
برخی از روش های بررسی تفاوت ها در فاز جامد عبارت اند از:
۱- آزمایش اتصال الیگونوکلئوتیدی (OLA) :
این روش برای شناسایی اختلافات تک نوکلئوتیدی در جایگاه های مکمل با انتهای کاوشگر های الیگونوکلئوتیدی مناسب است. در این روش از یک جفت کاوشگر الیگو نوکلئوتیدی (الیگومرها) استفاده می شود. کاوشگرهای الیگونوکلئوتیدی به ناحیه مجاور قطعه DNA که دارای باز متفاوت است هیبرید می شوند.
الیگومر در ناحیه ۵ (الیگومر ۵)، یک الیگو نوکلئوتید خاص آلل (ASO) برای یکی از آلل های ناحیه هدف است (هر آلل ASO خاص خود را دارد). آخرین باز در ناحیه ۳ الیگونوکلئوتید ASO، در سمت چند شکلی DNA هدف قرار گرفته است. همچنین این الیگونوکلئوتید در انتهای ۵ دارای یک مولکول بیوتین است که به صورت یک قلاب شیمیایی عمل می کند.
الیگونوکلئوتید در ناحیه ۳ (الیگومر ۳) یک الیگومر مشترک است که ردیف آن برای هر دو آلل یکسان است. الیگومر مشترک نیز نزدیک به ناحیه مجاور چند شکلی می چسبد و در انتهای ۳ خود با رنگ های فلوروسنت نشاندار شده است.
(آنالیز پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی در فاز جامد)
پس به طور خلاصه مراحل روش اُ،ال،اِ (OLA) شامل موارد زیر است:
الف – تکثیر ناحیه هدف به کمک پی.سی.آر؛
ب – دورگ گیری و اتصال کاوشگرهای خاص آلل یا کاوشگرهای الیگونوکلئوتیدی آ.اس.اُ:
در این حالت از سه نوع الیگو نوکلئوتید استفاده می شود. الیگونوکلئوتید اول همان الیگونوکلئوتید مشترک است که ردیف آن مکمل ردیف ناحیه مجاور آلل جهش یافته و آلل جهش نیافته است. دو الیگونوکلئوتید دیگر، دو نوع الیگونوکلئوتید . اس. هستند که فقط، از نظر تک باز در انتهای ۳ با همدیگر تفاوت دارند.
یکی از آنها مکمل ناحیه ۵ آلل نرمال و دیگری مکمل ناحیه ۵ آلل جهش یافته است. دو الیگونوکلئوتید (یکی اِ.اس.اُ و دیگری مشترک به ناحیه هدف می چسبند و به یکدیگر متصل می شوند. اتصال این الیگونوکلئوتیدها به کمک آنزیم لیگاز صورت می گیرد.
ج – جداسازی محصولات متصل شده به فاز جامد و شست وشوی کافی برای حذف الیگونوکلئوتیدهای غیر مجاور:
در این مرحله فقط محصولاتی که بیوتینیلاسیون شده اند به فاز جامد متصل خواهند شد.
د- آشکارسازی محصولات متصل شده از طریق میکروپلیت فلورومتر
۲- تکثیر جفتی و اتصال الیگونوکلئوتیدی (CAL)
این روش اجازه همزمان تعیین ژنوتیپ و تکثیر DNA را در یک آزمایش می دهد. البته در این روش نیاز به بهینه سازی دقیق و هزینه زیاد است.
۳- تجزیه ذره ژنتیک (GBA)
تجزیه ذره ژنتیک، یک روش ردیف یابی تک نوکلئوتیدی غیر پرتوزاست و در پلیت های میکروتیتر انجام می گیرد و شامل مراحل زیر است:
الف – پی.سی.آر ردیف دی.ان.ای هدف (دارای باز مختلف یا دارای اس. ان. پی های مختلف):
با استفاده از یک آغازگر مقاوم اگزونوکلئازی در هر جفت آغازگر: درحقیقت به ازای هر جفت آغازگر مورد استفاده، یکی از آغازگرها در انتهای ۵ فسفور وتیویت شده است؛
ب – انجام دورگ گیری دی.ان.ای تک رشته ای باقی مانده با یک آغازگر پیش ساخته شده جی.بی.اِ؛
د – توسعه آغازگر جی. بیا با ddNTPهای فلورسنت شده یا بیوتینیلیت شده و قطعه کلنو پلیمراز ؛
ه – آشکارسازی محصولات با استفاده از الایزا
و – تجزیه داده ها و تعیین ژنوتیپ نمونه ها.
۴ – ریزآرایه ها یا آرایش های الیگونوکلئوتیدی
(آنالیز پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی در فاز جامد)
منبع: کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران
دیدگاهتان را بنویسید