کشت آندروژنی:
تولید گیاه هاپلوئید از طریق کشت دانه گرده را آندروژنز (Androgenesis) گویند.
در روش آندروژنی، از گامتوفیت نر یک گیاه نهاندانه، یعنی میکروسپور برای تولید گیاه هاپلوئید استفاده می شود. اساس این روش، متوقف ساختن نمو سلول دانه گرده ای است که در جهت تبدیل شدن به یک گامت نر گام بر می دارد. یعنی توقف رشد و نمو یک سلول جنسی و هدایت مراحل نمو آن به طور اجباری به سوی تولید یک گیاه کامل. هاپلوئید را می توان با کشت بساک های قطع شده و کشت دانه های گرده جدا شده یا همان میکروسپور بدست آورد.
۱- کشت بساک:
۱- مرحله استریل:
جوانه های گل را که محتوی بساک های نابالغ بوده و میکروسپورها در درون کیسه های بساک محصورند، در مرحله مناسبی از نمو دانه گرده، از گیاه جدا کرده و پس از ضدعفونی سطحی، با آب مقطر استریل می شویند.
۲- کشت بساک:
با استفاده از گیره استریل (شعله دیده) کاسه گل از جوانه های گل جدا می شود. جام گل را شکافته و پرچم ها را در یک پتری دیش استریل قرار می دهند. به منظور پی بردن به مرحله نمو دانه های گرده، یکی از بساک ها در استوکارمین له می شود. اگر مشخص شد که جداسازی در مرحله مناسب صورت گرفته است، آنگاه بساک ها را به آرامی از میله پرچم جدا نموده و بساک های سالم و صدمه ندیده به صورت افقی به سطح کشت منتقل می شوند.
بساک های صدمه دیده معمولا دور ریخته می شوند، زیرا کشت بساک های صدمه دیده، به تولید کالوس از بافت دیواره آنها در محیط کشت می انجامد. در مواردی که با گیاهان ریزگل مانند جنس های Brassica و Trifolium سر و کار دارید، معمولا ممکن است استفاده از بینی کولار (استرئو میکروسکوپ) برای جدا کردن بساک ها لازم باشد.
نکته:
۱- بساک ها را می توان بر سطح یک محیط کشت جامد آگار در پتری دیش کشت داد. معمولا ۲۰-۱۰ بساک در یک پتری دیش ۶ سانتی متری قرار داده می شود.
۲- بساک ها را میتوان در محیط غذایی مایع نیز کشت کرد و تا ۵۰ بساک را در ۱۰ میلی لیتر محیط کشت مایع قرار داد.
۵- مرحله تولید گیاهچه و گیاه کامل:
در بساک هایی که پاسخ می دهند، بافت دیواره بساک ها به تدریج قهوه ای می شود و در مدت زمان ۸-۳ هفته این بساک ها، به دلیل فشار وارده از طرف کالوس دانه گرده و یا گیاهان هاپلوئید در حال رشد، شکافته می شوند. وقتی که این اندام ها به ارتفاع ۳ – ۵ سانتی متر رسیدند، گیاهچه های منفرد یا ساقه های خارج شده از کالوس را برداشته و به محیط کشت جدیدی که امکان نمو بیشتر را فراهم می کند، انتقال می دهند و گیاهان ریشه دار به خاک استریل درون گلدان منتقل می شوند.
۲- کشت دانه گرده
گیاهان هاپلوئید می توانند از طریق کشت این ویترو سلول های گامتوفیتی نر( میکروسپورها)، دانه گرده نارس تولید شوند.
رایج ترین روش کشت دانه گرده:
۱- بساک ها را از جوانه های استریل شده جدا نموده و در یک ارلن کوچک محتوی محیط کشت های پایه (مثلا ۵۰ بساک توتون در ۱۰ml محیط کشت) جمع می نمایند.
۲- این بساک ها را با استفاده از یک میله شیشه ای خمیده بر روی جداره داخلی ارلن فشار می دهند، که در اثر این فشار دانه های گرده از بساک ها خارج می شوند.
۳- مواد زائد بافت بساک با صاف کردن سوسپانسیون از خلال یک فیلتر نایلونی که قطر روزنه های آن اندکی از قطر دانه گرده بیشتر است (مثلا ۴۰ میکرون برای توتون و ۱۰۰ میکرون برای ذرت) از سوسپانسیون جدا می شوند.
از آنجا که دانه های گرده کوچک، قدرت باززایی گیاه را ندارند، بایستی با استفاده از فلیتر کردن سوسپانسیون، تراکم میکروسپورهای بزرگتر، خوب و بادوام را افزایش داد.
۴- سپس سوسپانسیون دانه گرده با دور کم به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ میشود. فاز رویی که محتوی مواد زائد بسیار ریز است، دور ریخته می شود. آنگاه توده دانه گرده را در محیط کشت تازه دوباره به صورت سوسپانسیون در آورده و حداقل دو بار شستشو داده می شود.
۵- میکروسپورهای حاصله با یک محیط کشت مناسب با تراکم ۱۰ تا ۱۰۰ میکروسپور در هر میلی لیتر مخلوط می شوند.
۶- سوسپانسیون نهایی با پیت به پتری دیش های کوچک انتقال داده می شود.
۷- میکروسپورهای پاسخ دهنده، به تولید جنین یا کالوس پرداخته و با انتقال آنها به محیط کشت مناسب میتوان به نمو بیشتر و گیاه کامل رسید.
نکته:
برای اطمینان از تهویه مطلوب، ضخامت لایه کشت در پتری دیش بایستی در حداقل ممکن باشد. هر پتری دیش برای جلوگیری از تبخیر آب با پارافیلم درزگیری شده و در انکوباتور قرار داده می شود.
منبع: کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.
دیدگاهتان را بنویسید