کشت سوسپانسیون سلولی
کشت سوسپانسیون سلولی، شامل توده های سلولی پراکنده و در حال رشد در محیط کشت مایع و جنبان است. این کشت ها معمولا با انتقال قطعاتی از کالوس ترد و تمایز نیافته به یک محیط کشت مایع که بطور یکنواخت و مداوم تکان داده می شود، شروع می شوند. کشت های سوسپانسیونی از جوانه های استریل، جنین یا برگ های متورم نیز به روش مکانیکی تهیه شده اند.
موفقیت در ایجاد گشت سوسپانسیون به کالوس اولیه بستگی دارد. استفاده از ریزنمونه های متنوع و محیط کشت های مختلفی نظیر MS ،B5 ،LS و بلایدز (Blay des)، برای القاء کالوس موفقیت آمیز بوده است. انواع متفاوتی از این محیط های غذایی همراه با تغییرات مناسب به طور گسترده استفاده می شوند. ویتامین ها، اینوزیتول، ساکارز و مواد تنظیم کننده رشد به ویژه اکسین (توفوردی به مقدار ۱ تا ۵ میکرومول) نیز به این محیط کشت ها اضافه می شوند. سرعت رشد و تردی کالوس تولید شده بسته به نوع ریزنمونه می تواند متفاوت باشد. محیط کشت مورد استفاده برای کشت سوسپانسیون بایستی به نحوی باشد که رشد خوب کالوس را تضمین نماید.
روش های اندازه گیری رشد سلول
۱- تعداد سلول:
تعداد سلول یک پارامتر رشد ضروری برای کشت های سوسپانسیونی است. تعداد سلول ها در توده های سلولی با تیمار تری اکسید کروم (Chromium trioxide) شمارش شود. یک حجم از کشت سوسپانسیون سلولی به چهار حجم محلول مایع ۱۲% (وزنی به حجمی) دی اکسید کروم اضافه شده و در دمای ۷۰ درجه سانتیگراد حرارت داده می شود تا سلول ها رنگ گرفته و پلاسمولیز شوند.
توده های سلولی با پمپ کردن توسط سرنگ تا حدودی نرم می شوند. مدت زمان حرارت دادن و میزان نرم کردن (Maceration) مورد نیاز، بسته به من کشت متفاوت است. پلاسمولیز شدن پروتوپلاست، عمل شمردن سلول ها در توده های سلولی را تسهیل می نماید. تعداد سلول ها را می توان با استفاده از یک میکروسکوپ معمولی شمرد.
۲- وزن تر:
سوسپانسیون سلولی را از خلال یک فیلتر نایلونی که وزن تر آن از قبل مشخص بوده و در دهانه یک قیف قرار داده شده است، عبور می دهند. سلول هایی را که در سطح فیلتر تجمع می یابند پس از شستشو با آب و زدودن محیط کشت از آنها با استفاده از پمپ خلاء آبکشی نموده و وزن آنها را اندازه گیری می نمایند. برای تخمین هر چه دقیق تر وزن تر با یک خطای قابل قبول، نمونه بزرگی لازم است.
٣- وزن خشک یا حجم سلول بسته بندی شده (Dry weight/ Packed cell volume) (PCV):
حجم مناسبی از کشت سوسپانسیون در یک سانتریفیوژ با لوله های مخروطی در g×۲۰۰۰ به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ شده و حجم رسوب یا حجم سلول بسته بندی شده یادداشت می شود. PCV به صورت میلی لیتر رسوب بر میلی لیتر کشت بیان می گردد. محلول بالایی لوله بیرون ریخته می شود و توده سلولی بر روی یک کاغذ صافی واتمن که وزن خشک آن مشخص میباشد شسته شده و در دمای ۸۰ درجه سانتیگراد به مدت یک شب خشک می گردد. سپس در یک دسیکاتور سرد شده و برای اندازه گیری وزن خشک، دو مرتبه وزن می شود.
منبع: کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.
دیدگاهتان را بنویسید