قابلیت حیات و تراکم پروتوپلاست
معمول ترین روش های رنگ آمیزی برای ارزیابی قابلیت حیات پروتوپلاست عبارتند از :
۱- روش رنگ آمیزی فلورسئین دیاستات (Fluorescein diacetate):
فلورسئین دی استات (FDA) رنگی است که در غشاء پلاسمایی پروتوپلاست های زنده تجمع می یابد و با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس قابل مشاهده است. با تجمع FDA در غشاء سلولی، پروتوپلاست های سالم و زنده در طی ۵ دقیقه تشعشعاتی به رنگ سبز مایل به زرد از خود ساطع می نمایند. FDA در استون حل می شود و با غلظت ۰/۰۱ ٪ مورد استفاده قرار می گیرد. پروتوپلاست های تیمار شده با FDA، باید ۱۵- ۵ دقیقه پس از رنگ آمیزی بررسی شوند، چون این رنگ پس از ۱۵ دقیقه از غشاء پلاسمایی جدا می شود.
۲- رنگ آمیزی با فنوسفرانین (Phenosafranine):
فنوسفرانین نیز با غلظت ۰/۰۱ ٪ به کار می رود، اما این ماده مخصوص پروتوپلاست های مرده است که پس از رنگ آمیزی به رنگ قرمز در می آیند. پروتوپلاست های زنده با استفاده از این ماده، بی رنگ باقی می مانند.
٣- رنگ آمیزی با کالکوفلوروایت (Calcofluor white):
کالکوفلوروایت (CFW) با آشکار ساختن مراحل اولیه سنتز دیواره سلولی جدید، پروتوپلاست های زنده را مشخص می نماید. CFW با زنجیره بتاگلوکوزیدی دیواره سلولی جدید باند می شود و آن را به صورت حلقه ای فلورسانس در اطراف غشاء سیتوپلاسمی آشکار می سازد. رنگ آمیزی مطلوب زمانی حاصل می شود که ۰/۱ میلی لیتر پروتوپلاست با ۵ میکرولیتر محلول۰/۰۱ ٪ W / V ) CFW ) مخلوط شود.
۴- بی رنگ ماندن غشاء های سالم در رنگ آمیزی با رنگ ایوانز بلو (Evans blue).
۵- مشاهده سیکلوز (Cyclosis) یا جریان پروتوپلاستی به عنوان معیاری برای متابولیسم فعال.
۶- تغییر اندازه پروتوپلاست با تغییر در پتانسیل اسمزی
۷- سنجش جذب اکسیژن با یک الکترود اکسیژن که بیانگر متابولیسم تنفسی می باشد.
۸- مطالعات فتوسنتزی.
با این وجود آزمون حقیقی قابلیت حیات پروتوپلاست ها، آزمون توانایی آنها در انجام تقسیمات میتوزی مداوم و باززایی گیاه است. برای رشد پروتوپلاست ها، حداقل و حداکثر تراکم از اهمیت زیادی برخوردار است. بر اساس مقالات منتشر شده، پروتوپلاست ها را بایستی با تراکم ۱۰-۱۰ × ۵ سلول در هر میلی لیتر که حد مطلوب آن ۱۰ × ۵ سلول در هر میلی لیتر است، کشت نمود. تراکم پروتوپلاست ها در یک سوسپانسیون را می توان با استفاده از هموسایتومتر (Hemocytometer) تعیین کرد.
منبع: کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.
دیدگاهتان را بنویسید