روش های امتزاج پروتوپلاست

امتزاج پروتوپلاست

امتزاج پروتوپلاست عبارت است از اختلاط پروتوپلاست های متعلق به دو ژنوم مختلف که می تواند به دو روش خود به خودی و القائی صورت پذیرد.

روش امتزاج خودبه خودی:

امتزاج سلولی فرآیندی معمول در چرخه زندگی گیاهان است. برجسته ترین مورد آن، باروری تخم می باشد. از بین رفتن دیواره سلولی در طی جداسازی پروتوپلاست ها، محققین را به این عقیده سوق داد که بایستی نوعی امتزاج خود به خودی برای تولید همو کاریون ها وجود داشته باشد. چون بلافاصله پس از کاربرد روش های جداسازی پروتوپلاست، سلول های چند هسته ای مشاهده شدند.

مطالعات الکترون میکروگرافی نشان داد که هضم دیواره سلولی باعث اتساع پلاسمودسماتا و امتزاج و اختلاط کامل سلول ها می شود. امتزاج خودبه خودی پروتوپلاست ها زمانی مشاهده می گردد که پروتوپلاست ها از کشت های کالوس جداسازی شوند. با این وجود هیبریدهای حاصل از امتزاج خود به خودی پروتوپلاست ها، قادر به باززایی گیاهان کامل نیستند و فقط به چند دوره تقسیمات اندک میتوزی بسنده می کنند. مطالعات بعدی مشخص نمود که پروتوپلاست های جداسازی شده، معمولا از سطوح صاف برخوردارند و برای امتزاج آنها باید از تیمارهای خاص استفاده کرد.

روش امتزاج القایی:

در فرآیند هیبریداسیون سوماتیکی که هدف آن امتزاج پروتوپلاست هایی با منشا مختلف است، امتزاج خودبه خودی ارزشی ندارد. برای نائل شدن به این هدف، ماده مناسبی به نام فیوژن (Fusogen) برای امتزاج پروتوپلاست ها با منشأهای متفاوت اضافه می شود.

۱- تیمار با نیترات سدیم:

پاور و همکاران در سال ۱۹۷۰ برای اولین بار امتزاج پروتوپلاست ها را با استفاده از نیترات سدیم (NaNO3) گزارش نمودند.

• مراحل:

۱- پروتوپلاست های جداشده، در مخلوطی از نیترات سدیم ۵/۵ درصد در محلول ۱۰٪ ساکارز به حالت تعلیق در می آیند.

۲- محلول محتوى پروتوپلاست ها را در حمام آب گرم در دمای ۳۵°C به مدت ۵ دقیقه قرار داده و سپس با دور ۲۰۰×g و به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ می نمایند.

۳- پس از سانتریفیوژ، بخش عمده ای از محلول فوقانی را دور ریخته و مقدار باقیمانده به همراه توده پروتوپلاست ها به حمام آب گرم در دمای ۳۰°C به مدت ۳۰ دقیقه منتقل می شود. در طی این مرحله، بیشتر پروتوپلاست ها با یکدیگر امتزاج می یابند.

۴- بقیه محلول تلفیق را خارج نموده و آن را با محیط کشتی که حاوی ۰/۱ درصد نیترات سدیم است، جایگزین می نمایند.

۵- پروتوپلاست ها را در همین وضعیت، مدتی نگه می دارند و سپس آنها را با استفاده از محیط کشت، دو دفعه شستشو داده و بعد کشت می کنند. در این تکنیک، فراوانی تشکیل هتروکاریون ها کم است، به ویژه زمانی که از پروتوپلاست های مزوفیل برگ استفاده شود.

جشنواره پاییزه

جشنواره فروش بذر های خاص و کمیاب با بیش از ۱۲۰۰ رقم تنوع

همین الآن خرید کنید

۲- استفاده از یون های کلسیم در pH بالا:

کلر (Keller) و ملشرز (Melchers) در سال ۱۹۷۳، تأثیر pH بالا و یون های کلسیم را بر امتزاج پروتوپلاست های توتون مطالعه کردند. در این روش، پروتوپلاست های جداشده را در یک محلول القاء کننده امتزاج که محتوی ۰/۵ M مانیتول و M ۰/۰۵ کلرید کلسیم دو آبه بوده، به مدت ۳ دقیقه با دور ۵۰×g سانتریفیوژ می کنند. سپس لوله های سانتریفیوژ محتوی پروتوپلاست ها را به مدت ۵۰-۴۰ دقیقه در حمام آبگرم با دمای ۳۷°C قرار می دهند. پس از این تیمار، ۵۰-۲۰٪ پروتوپلاست ها با یکدیگر امتزاج مییابند.

۳- روش پلی اتیلن گلیکول:

کائو (Ka0) و میشایلوک (Michayluk) در سال ۱۹۷۴، و والین و یاران در همان سال، روش استفاده از PEG را برای امتزاج پروتوپلاست ها ابداع نمودند. این روش یکی از موفق ترین تکنیک ها برای امتزاج پروتوپلاست ها می باشد. پروتوپلاست ها را محلولی که محتوی پلی اتیلن گلیکول با وزن مولکولی بالا می باشد، به حالت سوسپانسیون می آورند.

محلول فوق عمل چسبیدن پروتوپلاست ها به یکدیگر و امتزاج آنها در بسیاری از گونه های گیاهی را سرعت می بخشد. اگر مقادیر کافی از پروتوپلاست ها در دسترس باشد، ۱ml سوسپانسیون پروتوپلاستی را با ml ۱ محلول ۵۶-۲۸٪ پلی اتیلن گلیکول با وزن مولکولی ۶۰۰۰-۱۵۰۰ در یک محیط کشت مخلوط می نمایند.

لوله محتوی مواد فوق را به مدت ۵ ثانیه تکان می دهند و سپس آن را به مدت ۱۰ دقیقه ثابت نگه می دارند تا مواد موجود در آن ته نشین شوند. سپس برای حذف PEG، پروتوپلاست ها را چند مرتبه با محیط کشت پروتوپلاست شستشو می دهند. به دلیل تشکیل هتروکایون ها با فراوانی زیاد، سمیت کم برای غالب انواع سلول ها و تشکیل هتروکایون های دو هسته ای، روش PEG به صورت گسترده ای مورد قبول واقع شده است. امتزاج القایی با استفاده از PEG یک روش اختصاصی نیست، بنابراین برای امتزاج های بین گونه ای (Inter – specific)، بین جنسی (Inter- generic) و بین سلسله ای (Inter-kingdom) قابل استفاده است.

۴- الکتروفیوژن:

پروتوپلاست ها در یک ظرف کشت کوچک که دارای دو الکترود می باشد قرار داده می شوند. سپس یک اختلاف پتانسیل الکتریکی برقرار می گردد که باعث می شود پروتوپلاست ها به صورت ردیفی در حد فاصل الکترودها قرار گیرند. در این حالت اگر یک شوک الکتریکی موج کوتاه، به شدت اعمال گردد، پروتوپلاست ها را تحریک به امتزاج می نماید.

• این روش امتزاج، از دو مرحله تشکیل یافته است:

• مرحله اول:

با اعمال یک جریان الکتریکی متناوب کم شدت بر سوسپانسیون پروتوپلاستی شروع می شود. هنگامی که هدایت الکتریکی محیط کشت سوسپانسیونی کمتر از sec/cm ۱۰۵ باشد و جریان متناوبی با پتانسیل ۱/۵ ولت و فرکانس مگاهرتز (MHZ) برقرار گردد، در اثر جریان الکتروفورزی حاصل، سلول ها در طول خطوط میدان الکتریکی به یکدیگر می چسبند.

• در مرحله دوم:

یک جریان الکتریکی مستقیم با شدتی معادل V/ cm ۷۵۰ – ۱۰۰۰ در مدت زمان ۵۰-۲۰ میکرو ثانیه در مدار برقرار می گردد که برقراری این جریان موجب شکستن غشاء پلاسمایی سلول ها در ناحیه اتصال آنها به یکدیگر می شود. پس از شکستن غشاء پلاسمایی در ناحیه اتصال، دو سلول با یکدیگر امتزاج می یابند و غشاء پلاسمایی مجددا شکل می گیرد. تکنیک الکتروفیوژن، ساده و سریع است و بازده بالایی دارد. سلول ها پس از الکتروفیوژن سمیت نشان نمی دهند. با این وجود، این تکنیک به دلیل نیاز به تجهیزات خاص از مقبولیت چندانی برخوردار نگردیده است.

منبع:  کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.

رسول رحیم پور