تاریخ :۱۶ بهمن ۱۴۰۱
مزایای سیستم های کشت سلولی برای تولید متابولیت های ثانویه:

روش کشت سوسپانسیون سلولی در توتون

  • مواد گیاهی:

    • گیاه توتون

    جوانه زنی بذر توتون:

    ١- بذرها را در آب محتوی چند قطره ماده شوینده در یک بالون فرو برده و با تکان دادن بالون، آنها را شستشو دهید، یا آنها را در یک صافی پارچه ای با نایلونی نازک ریخته و با آب بشوئید.

    ۲- بذرها را در محلول الکل ۷۰٪ به مدت ۶۰- ۳۰ ثانیه غوطه ور نموده و سپس الکل را بیرون بریزید.

    ۳- بذرها را به یک بالون یا ارلن محتوی محلول تجارتی هیپو کلریت سدیم با غلظت ۴۰-۲۰ درصد به مدت ۳۰-۱۵ دقیقه انتقال داده و سپس با آب مقطر استریل، ۵ مرتبه شستشو دهید.

    ۴- دو تا سه عدد بذر را در سطح محیط کشت MS بدون مواد تنظیم کننده رشد قرار دهید.

    ۵- کشت ها را به مدت ۲-۱ هفته در دمای ۲۵درجه سانتیگراد تحت فتوپریود ۱۶ ساعته با شدت نورک در حدود ۱۰۰۰ لوکس قرار دهید.

    ۶- هر هفته کشت ها را از نظر آغاز ریشه دهی بررسی نمایید. گیاهچه های متفرد را در صورت نیاز به محیط کشت MS نیمه غلظت منتقل نمایید.

    تهیه ریزنمونه

    ۱- گیاهچه های استریل را پس از آنکه کوتیلدون آنها به طور کامل رشد یافت و اپیکوتیل شروع به خروج نمود، جدا نمایید. معمولا این پدیده وقتی که گیاهچه ها دو هفته سن دارند، رخ می دهد. هر گیاهچه را روی یک لام یا پتری دیش استریل قرار داده و ریزنمونه های مورد نظر را از آن تهیه نمایید.

    ۲- از ریزنمونه های مختلفی می توان استفاده نمود: نوک ساقه را با کوتیلدون ها و یا بدون آنها قطع نموده و قاعده ساقه را در محیط کشت قرار دهید. از کوتیلدون ها و قطعات هیپوکوتیل جوانه های سر برداری شده نیز می توان استفاده کرد.

    کشت ریزنمونه

    ۱- ریزنمونه ها را در محیط غذایی MS + ۱ – ۲ mg/l 2,4 – D) MSN) کشت دهید.

    ۲- کشت ها را در تاریکی و دمای ۲۵ درجه سانتیگراد در انکوباتور قرار دهید. بافت کالوس در مدت زمان ۳ – ۴ هفته تولید خواهد شد.

    ۳- قطعات کوچکی با وزن تر حدود ۰/۵ گرم از بافت کالوس را برش داده و در نوع تازه همان محیط کشت برای تکثیر مجدد کشت دهید.

    ۴- محیط کشت MSN مایع (بدون آگار) تهیه نمایید. برای اهداف آزمایشی، ۱۵ میلی لیتر محیط کشت را در یک ارلن ۱۲۵ میلی لیتری ریخته و دهانه ارلن را با شعله چراغ در زیر هود استریل نمایید.

    ۵- قطعه ای به قطر تقریبی ۲ سانتی متر از کالوس را به یک پتری دیش منتقل نمایید و به آرامی با استفاده از پس آن را به ۳۰-۲۰ قطعه کوچک تبدیل کنید.

    ۶- با استفاده از پنس، این قطعات کوچک را به محیط کشت های مایع انتقال دهید.

    ۷- دهانه ظرف کشت را با استفاده از شعله استریل نموده و درپوش استریل را بر دهانه آن قرار دهید. چند نمونه تهیه نمایید.

    جشنواره پاییزه
    جشنواره فروش بذر های خاص و کمیاب با بیش از ۱۲۰۰ رقم تنوع
    همین الآن خرید کنید

    ۸- ظروف کشت را بر روی شیکری با سرعت rpm ۱۲۵ و در اتاقی با دمای کنترل شده قرار دهید.

    • مرحله واکشت

    ۹- هر هفته تجدید کشت کنید. برای چند واکشت اول با کمک پیپت استریل بزرگ، بخشی از محیط کشت قبلی را برداشته و با همان مقدار محیط کشت تازه جایگزین نمایید. پس از آنکه توده سلولی تقریبا دو برابر شد، این کشت را با دقت در دو ظرف کشت جداگانه که محتوی مقادیر مساوی از محیط کشت تازه باشند، تقسیم نمایید. دوره اینکوباسیون را تکرار کنید.

    ۱۰- پس از آنکه کشت سوسپانسیونی تثبیت شد و توده های سلولی موجود در آن از توزیع خوب و یکنواختی برخوردار گردیدند، اختلاط محیط کشت کهنه با محیط کشت تازه به نسبت ۱ به ۴ تا ۱ به ۱۰ برای حفظ لاین سلولی در دوره های زمانی ۱۰-۷ روزه کافی به نظر می رسد. با قرار دادن یک قطره از کشت بر روی یک لام شیشه ای در شرایط استریل می توان سوسپانسیون سلولی را در زیر میکروسکوپ مشاهده نمود.

     

    منحنی رشد سوسپانسیون سلولی

    ۱- برای بررسی منحنی رشد در طول زمان، از یک لاین سوسپانسیون سلولی تثبیت شده استفاده نمایید. به منظور تهیه اینو کولوم یکنواخت برای هر تکرار، چند کشت را به دقت در یک ظرف کشت بزرگتر با هم مخلوط کنید.

    ۲- ۲۵ میلی لیتر محیط کشت MSN مایع را به درون یک ارلن ۱۲۵ میلی لیتری ریخته و ۵ میلی لیتر از اینو کولوم را به وسیله پیپت به آن بیفزائید. حداقل ۴ تکرار تهیه نمایید.

    ۳- در شرایط استریل، ۱۰ میلی لیتر از هر کشت را به تیوب های سانتریفیوژ به طور جداگانه انتقال داده و پس از سانتریفیوژ به مدت ۵ دقیقه، حجم توده سلولی (PCV) را در هر تیوب اندازه بگیرید. آنچه در این مرحله بدست می آید ارزش زمان صفر خواهد بود.

    ۴- ۱۰ میلی لیتر محیط کشت به سلول های درون تیوب سانتریفیوژ بیفزائید و آنها را دوباره به صورت سوسپانسیون در آورده و به ترتیب به ظروف کشت مربوط به خود برگردانید. سوسپانسیون ها را بر روی شیکر چرخان انکوبه نمایید. این عمل بایستی تحت شرایط استریل و شدید کنترل شده انجام گیرد چون احتمال آلودگی در این مرحله زیاد است.

    ۵- مراحل ۳ و ۴ را هر ۳-۲ روز یکبار به مدت ۳ هفته تکرار نمایید. میانگین PCV و انحراف استاندارد (Sd) را برای هر بار نمونه برداری محاسبه نموده و منحنی رشد را رسم نمایید.

     

    منبع:  کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.

    امتیاز شما به این مقاله چقدره؟

    میانگین امتیازات ۵ از ۵

    دیدگاهتان را بنویسید

    نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.