برگمن در سال ۱۹۶۰ برای اولین بار، تکنیک پخش سلول های کشت سوسپانسیون سلولی بر سطح محیط کشت آگار را ابداع نمود. این تکنیک بویژه برای تهیه کلنی های تک سلول بسیار سودمند است. در این تکنیک، سوسپانسیون سلولی یکنواختی در یک لایه نازک محیط کشت ایجاد می شود. تراکم سلولی در این سوسپانسیون آنقدر کم است که تعداد زیادی از واحدهای تک سلولی و توده های سلولی می توانند به تولید کلنی بپردازند.
روش کار:
- اساس تکنیک بخش کردن این است که در ابتدا تعداد سلول ها بدون نرم کردن توده های سلولی شمارش شود. این امر باعث میشود که تعداد مشخصی از واحدهای سلولی در هر واحد حجم از محیط غذایی بخش گردد. سوسپانسیون شمارش شده با رقیق کردن یا غلیظ کردن محیط کشت با استفاده از سانتریفیوژ با دور کم، تعدیل می گردد.
- در این تکنیک، سوسپانسیون سلولی و محیط کشت محتوی آگار به طور جداگانه، هر یک با غلظت دوبرابر تهیه میشوند.
- مقادیر مساوی از سوسپانسیون و محیط کشت آگاردار سرد شده در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد را پس از اختلاط، سریعا به درون پتری دیش می ریزند، به نحوی که سلول ها به طور یکنواخت در لایه نازکی به ضخامت تقریبی ۱ میلی متر پراکنده شوند.
- کشت سوسپانسیونی که محتوی توده های سلولی می باشد، بایستی با عبور از یک صافی صاف شود و فقط از سوسپانسیون رقیق برای پخش استفاده شود.
- تعداد واحدهای سلولی در هر میلیمتر مربع با استفاده از میکروسکوپ معکوس به طور مستقیم شمارش می شود.
- سپس ظروف کشت را مهر و موم نموده و در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد به مدت ۲۱ روز در انکوباتور قرار می دهند.
- پس از انکوباسیون، تعداد کلنی ها در هر پلیت، با تهیه عکس های سایه روشن از هر پلیت که با قرار دادن آن بر روی یک صفحه کاغذ عکاسی در زیر یک آگراندیسمان تهیه می گردد، شمارش می شود.
- در این روش فوتوگرافی، کلنی هایی که با استفاده از دستگاه استاندارد کلنی شمار باکتری ها به آسانی مشاهده نمیشوند، به وضوح ثبت می شوند.
منبع: کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.
دیدگاهتان را بنویسید