mag.dibasabz.com/cereal-embryo-tissue-culture
مرحله کشت جنین
١- اندام باردهی گیاه مانند بلال در ذرت، پانیکول در برنج و سنبله مرکب در گندم و جو را پس از گذشت ۱۴-۱۲ روز از زمان تلاقی یا گرده افشانی، زمانیکه بذرهای در حال نمو در مرحله شیری هستند، جدا نمایید. قطر جنین در این مرحله، حدود ۱/۵ میلی متر است. اندازه جنین را در زیر بینو کولار مورد بررسی قرار دهید. به کمک گیره و یا سوزن، بذرها را از بلال، پانیکول و یا سنبله جدا نموده و پوشینه و پوشینک را در صورت وجود، حذف نمایید
۲- چند عدد از این بذرها را در یک بشر ریخته و با محلول ۲۰٪ هیپوکلریت سدیم تجارتی به مدت ۱۰ دقیقه ضدعفونی نمایید. این اعمال بایستی در زیر هود لامینار ایرفلو انجام شود. سپس بذرها را ۳ الی ۵ مرتبه با آب مقطر استریل شستشو دهید.
۳- هر بذر استریل شده را بر روی یک سطح استریل یا در کف پتری استریل قرار داده و در حالیکه بذر را با یک سوزن ثابت نگه داشته اید، با سوزن دیگری در بافت آندوسپرم ناحیه فوقانی جنین، شکافی ایجاد نمایید.
۴- در اتاقک هود لامینار ایرفلو با استفاده از میکروسکوپ تشریح، جنین های نارس را که ۱/۵-۱ میلیمتر قطر دارند، از بذرها بیرون آورید.
مرحله القاء کالوس
۱- برای القاء بافت کالوس، ۵ تا ۶ عدد جنین را بنحوی که ناحیه اسکوتلوم آنها (بافت جایگزین آندوسپرم در غلات) به سمت بالا باشد، در یک ظرف کشت بر روی محیط کشت MS + 2 mg/l 2,4- D قرار دهید.
۲- کشت ها را در تاریکی و دمای ۲۵ درجه سانتیگراد در انکوباتور قرار دهید. جنین ها در ابتدا متورم شده و سپس در طی ۴-۳ هفته، بافت کالوس از اسکوتلوم تولید می شود. جنین هایی که قطر آنها بیش از ۲ میلی متر باشد، به طور نابهنگام به گیاه تبدیل می شوند.
۳- اگر کالوس منشأ گرفته از بافت اسکوتلوم را ۶-۴ هفته پس از تولید به ۳-۲ قطعه تقسیم نموده و به محیط کشت مشابهی انتقال دهید، این قدرت را دارد که حداقل یک بار تکثیر شود.
۴- قطعات سفت و متراکم کالوس را به اندازه ۰/۵ سانتیمتر مربع برش داده و برای تکثیر به محیط کشت مشابهی انتقال دهید.
آغاز کشت سوسپانسیون سلولی
۱- محیط کشت MSN مایع (بدون آگار) تهیه نمایید. برای اهداف آزمایشی، ۱۵ میلی لیتر محیط کشت را در یک ارلن ۱۲۵ میلی لیتری ریخته و دهانه ارلن را با شعله چراغ در زیر هود استریل نمایید.
۲- قطعه ای به قطر تقریبی ۲ سانتی متر از کالوس را به یک پتری دیش منتقل نمایید و به آرامی با استفاده از پس آن را به ۳۰-۲۰ قطعه کوچک تبدیل کنید.
۳- با استفاده از پنس، این قطعات کوچک را به محیط کشت های مایع انتقال دهید.
۴- دهانه ظرف کشت را با استفاده از شعله استریل نموده و درپوش استریل را بر دهانه آن قرار دهید. چند نمونه تهیه نمایید.
۵- ظروف کشت را بر روی شیکری با سرعت rpm ۱۲۵ و در اتاقی با دمای کنترل شده قرار دهید.
۶- هر هفته تجدید کشت کنید. برای چند واکشت اول با کمک پیپت استریل بزرگ، بخشی از محیط کشت قبلی را برداشته و با همان مقدار محیط کشت تازه جایگزین نمایید. پس از آنکه توده سلولی تقریبا دو برابر شد، این کشت را با دقت در دو ظرف کشت جداگانه که محتوی مقادیر مساوی از محیط کشت تازه باشند، تقسیم نمایید. دوره اینکوباسیون را تکرار کنید.
۷- پس از آنکه کشت سوسپانسیونی تثبیت شد و توده های سلولی موجود در آن از توزیع خوب و یکنواختی برخوردار گردیدند، اختلاط محیط کشت کهنه با محیط کشت تازه به نسبت ۱ به ۴ تا ۱ به ۱۰ برای حفظ لاین سلولی در دوره های زمانی ۱۰-۷ روزه کافی به نظر می رسد. با قرار دادن یک قطره از کشت بر روی یک لام شیشه ای در شرایط استریل می توان سوسپانسیون سلولی را در زیر میکروسکوپ مشاهده نمود.
اندازه گیری رشد سوسپانسیون سلولی
۱- برای بررسی منحنی رشد در طول زمان، از یک لاین سوسپانسیون سلولی تثبیت شده استفاده نمایید. به منظور تهیه اینو کولوم یکنواخت برای هر تکرار، چند کشت را به دقت در یک ظرف کشت بزرگتر با هم مخلوط کنید.
۲- ۲۵ میلی لیتر محیط کشت MSN مایع را به درون یک ارلن ۱۲۵ میلی لیتری ریخته و ۵ میلی لیتر از اینو کولوم را به وسیله پیپت به آن بیفزائید. حداقل ۴ تکرار تهیه نمایید.
۳- در شرایط استریل، ۱۰ میلی لیتر از هر کشت را به تیوب های سانتریفیوژ به طور جداگانه انتقال داده و پس از سانتریفیوژ با سرعت g×۲۰۰۰ به مدت ۵ دقیقه، حجم توده سلولی (PCV) را در هر تیوب اندازه بگیرید. آنچه در این مرحله به دست می آید ارزش زمان صفر خواهد بود.
۴- ۱۰ میلی لیتر محیط کشت به سلول های درون تیوب سانتریفیوژ بیفزائید و آنها را دوباره به صورت سوسپانسیون در آورده و به ترتیب به ظروف کشت مربوط به خود برگردانید. سوسپانسیون ها را بر روی شیکر چرخان انکوبه نمایید. این عمل بایستی تحت شرایط استریل و شدید کنترل شده انجام گیرد چون احتمال آلودگی در این مرحله زیاد است.
۵- مراحل ۳ و ۴ را هر ۳-۲ روز یکبار به مدت ۳ هفته تکرار نمایید. میانگین PCV و انحراف استاندارد (Sd) را برای هر بار نمونه برداری محاسبه نموده و منحنی رشد را رسم نمایید.
منبع: کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.
دیدگاهتان را بنویسید